Augstvērtīgu produktu ieguves izpēte, izmantojot mikroaļģu kultivāciju laboratorijas un pilota mērogā fotobioreaktoros
Eiropas Reģionālā attīstības fonda projekts
(LīgumaNr.2013/0041/2DP/2.1.1.1.0/13/APIA/VIAA/025)
Darbības programma “Uzņēmējdarbība un inovācijas”
Papildinājuma 2.1.prioritāte “Zinātne un inovācijas”
Pasākums 2.1.1. ” Zinātne, pētniecība un attīstība”
Aktivitāte 2.1.1.1. “Atbalsts zinātnei un pētniecībai”
Projekta mērķis ir izstrādāt astaksantīna ekstrakcijas tehnoloģiju Latvijas apstākļos un izveidot vadāmu laboratorijas un pilota mēroga fotobioreaktoru.
SIA „Belss” mērķis ir izstrādāt astaksantīna ekstrakcijas tehnoloģiju; AS „Biotehnoloģiju centrs” mērķis ir izveidot vadāmu laboratorijas un pilota mēroga fotobioreaktoru.
Projekta ietvaros plānotas šādas aktivitātes:
Ir uzsākti pētījumi projekta 1. Aktivitātē:  Pētījums par ārējās vides faktoru ietekmi uz mikroaļģu kultivāciju.
Šo faktoru izpētei, tiek izmantota aļģu kultūra Desmodesmus communis. Pētījuma mērķis ir radīt izejas informāciju aļģu kultivācijas fotobioreaktora izveidei.  Tiek pētīta sekojošo faktoru ietekme:
1. Temperatūra;
2. Apgaismojums;
3. Maisīšana;
4. Aerācija;
5. CO2.
Šo parametru ietekme tiek pētīta, variējot apstākļus kratītāja kolbu eksperimentos.
Izpētei, dotā projekta ietvaros, ir izveidota „Aļģu audzēšanas sistēma”. Dotā sistēma sastāv no 3 grupām attiecībā uz maisīšanas/ aerācijas režīmu modelēšanu:
1.      Grupa: Maisīšana ar kratītāju (Biosan PSU-20i), aerācija ar barbotieri;
2.      Grupa: Maisīšana ar kratīšanu, bez aerācijas;
3.      Grupa: Aerācija ar barbotieri, bez kratīšanas.
Tiek izmantotas attiecīgi aprīkotas 500ml kolbas.
Galvenais maisīšanas nodrošināšanas veids ir kratīšana. Kratītājā ir iespējams iestatīt dažāda veida un intensitātes kratīšanas režīmus. Kratīšanas laikā notiek arī daļēja aerācija, jo caur ārējo virsmu notiek krasas apmaiņas starp kolbās esošo gaisu un kultivācijas vidi. Aerācija tiek nodrošināta ar speciālas konstrukcijas mikroaeratoriem. Aeratoram tiek pievadīts gaisa un CO2maisījums. Gaisa un CO2 sajaukšana notiek 250ml pudelītēs, kurām izejā ir pievienots mikrobioloģiskais filtrs (gaisa elpināšanas nodrošināšanai, t.i., spiedienu izlīdzināšanai). Gaisa un CO2 daudzumi tiek iestatīti ar rotametru palīdzību. CO2 plūsmas daudzums tiks variēts procesa gaitā, mainot to atkarībā no pH vērtības izmaiņas dinamikas. pH tiks noteikts ņemot paraugu vidēji reizi dienā.
Rotametri ir attiecīgi pieslēgti gaisa kompresora un CO2 balona līnijām. Gaisa kompresora un CO2 balona līnijās ir pievienoti regulējošie reduktori, kuri nodrošina nemainīgu spiedienu padeves līnijās. Tādā veidā tiek nodrošināts vienāds spiediens visu rotametru ieejās. Tā rezultātā arī caur rotametriem plūsmu daudzumi ir atbilstoši iestatītajā vērtībām, t.i., tie nemainās, ja kādā no aerācijas līnijām mainās pretestība. Ar aerāciju tiek nodrošināta arī samaisīšana. Tādā veidā 1.grupas konfigurācijā kombinējas 2 veidu samaisīšanas ietekmes faktori. Aerācijas gadījumā ir nepieciešams kolbas aprīkot izejās ar kondensoriem – dzesētājiem. Tie nodrošina izplūstošā gaisa mitruma kondensēšanos atpakaļ kratītāja kolbā. Ja netiktu izmantoti kondensori, tad līdz ar gaisa plūsmu mitruma veidā tiktu iznests apkārtējā vidē daļa no kultivācijas šķīduma. Tā rezultātā samazinātos kultivācijas vides tilpums un barošanai nepieciešamās vielas.
Kombinējot maisīšanu ar kratīšanu, kas zināmā mērā ir arī aerācija, un aerāciju ar barbotieri, kas nodrošina arī maisīšanu, varēs noskaidrot cik liela ietekme ir katram no minētajiem maisīšanas un aberācijas veidiem.
Visās kolbās tiks nodrošināta nemainīga temperatūra t=260C. Saskaņā ar literatūras datiem, dotā veida aļģu kultūrai temperatūra t=260C atrodas optimālā diapazona robežās. Saskaņā ar pieejamo informāciju, optimālās temperatūras diapazons šai aļģu kultūrai ir diezgan plašs (±20C) un līdz ar to nav nepieciešams temperatūru dažādos eksperimentos variēt.
Gaismas avota ietekmes pārbaudei kolbās pielietojam LED gaismas diožu lokanas lentas. Uz šādas lentas ir vienmērīgā attālumā izvietotas gaismas diodes. Doto lentu var izveidot nepieciešamā garumā, atbilstoši kolbas konfigurācijai, diametram un kopējam garumam. Mūsu eksperimentu gadījumos uz vienu kolbu izvietojamais kopējais gaismas diožu garums ir 2 metri. To intensitāte tiks regulēta ar dimmeri. Dimmers nodrošina dažādu spriegumu uz gaismas diožu spailēm. Gaismas diodes ir iespējams izvietot ap kolbu ar dažādām intensitātēm. Lai izvērtētu nepieciešamo gaismas diožu izvietošanas intensitāti.

Balstoties uz 1. aktivitātē veiktajiem pētījumiem par ārējās vides faktoru ietekmi uz mikroaļģu kultivāciju, tiek veidots Laboratorijas fotobioreaktora prototips.

Izveidotā laboratorijas fotobioreaktora prototipa tehniskie dati un koncepcionālā risinājuma principi ir sekojošie:

  1. Kopējais tilpums – 6 litri (darba tilpums 4 litri);
  2. Augšējā magnētiskā maisīšanas piedziņa;
  3. Borisilikāta stikla cilindriskā daļa ar nerūsējošā tērauda vāku un apakšējo daļu;
  4. Temperatūras regulēšana notiek caur apvalku, kurš iemontēts bioreaktora apakšējā daļā. Apvalks ir savienots ar termostatu, kurā tiek iestatīta un uzturēta nepieciešamā temperatūra. Temperatūras sensors tiek iegremdēts bioreaktora traukā caur bioreaktora vāku;
  5. Aerācija tiek veikta ar gaisa un CO2 maisījumu. Šāds maisījums tiek veidots, padodot caur vienu spiediena reduktoru un rotametru nepārtrauktu gaisa plūsmu, bet caur otru spiediena reduktoru un rotametru CO2 plūsmu ar impulsiem. Šie impulsi ir iestatāmi manuāli vai automātiski tā, lai tiktu nodrošināta CO2 koncentrācija 0.1 – 20%;
  6. Papildus kultivācijas vidē tiek mērīts vides skābums pH un izšķīdušā skābekļa parciālais spiediens. Abi sensori tiek iegremdēti kultivācijas vidē. PH sensora pārveidotais signāls tiek izmantots, lai automātiski regulētu CO2 impulsu garumu (jeb CO2 koncentrāciju) ieejošā gaisa plūsmā;
  7. Apgaismojums kultivēšanai tiek nodrošināts caur vāku, iegremdējot kultivācijas vidē 2 – 4 speciāli izveidotus LED gaismas avotus, kuri ir ievietoti speciāli izgatavotos stikla stobriņos. Šāds risinājums ir kā alternatīva līdz šim pielietotam cilindriskās daļas aptverošās LED diožu laukumam. Iegremdējamo LED cilindru priekšrocība ir tā ērtāka mērogošana iespēja, palielinot fotobioreaktora tilpumu;
  8. Parauga noņēmējs reaktora apakšējā daļā;
  9. Savienojumi vākā titrantu un substrāta padevei, kā arī papildus porti;
  10. O2 un CO2 mērīšanas iespēja izejošā gaisa plūsmā, izmantojot BlueSens gāzes analizatorus.

Maza mēroga (0,5 litri) laboratorijas bioreaktoros tiek pētīti dažādi maisīšanas, aerācijas, CO2 padeves un apgaismojuma variācijas pētījumi, lai rastu nosacījumus Haematococus pluvialis un citu aļģu kultūru kultivācijai pilota mēroga bioreaktoros.

Video

Pilota mēroga fotobioreaktora prototips (50 litri)

Izmantojot laboratorijas un pilota mēroga fotobioreaktorus, tika veikti mēroga pārejas likumsakarību pētījumi. Šādi pētījumi ir būtiski, lai varētu izstrādāt lielākus mēroga fotobioreaktorus un novērtēt dažādu mikroaļģu kultivācijas procesus dažādos mērogos.

Projektējot fotobioreaktoru, par pamatkritērijam pēc kuriem jāvadās var nosaukt apgaismojumu, samaisīšanu un aerāciju. Apgaismojums ir pamatparametrs, jo tas ir galvenais aļģu augšanas limitējošais faktors. Īpaši jāņem vērā, tas, ka pārāk liels apgaismojums var izraisīt fotoinhibēšanu un šūnas bojāšanu. Aerēšana – nodrošina masapmaiņu starp fotobioreaktora gāzes un šķidro fāzi, bet ir arī tāda tipa reaktori, kuros aerēšana ir vienīgais samaisīšanas veids. Aerācija veicina oglekļa avota (CO2) ievadīšanu fotobioreaktorā un skābekļa izvadīšanu. Maisīšana – tās galvenais uzdevums ir novērst šūnu sedimentēšanu un nodrošināt to cirkulēšanu no tumšās zonas uz apgaismoto. Jāņem vērā arī tas, ka liels maisītāja griešanās ātrums var sabojāt mikroaļģu šūnas.

Laboratorijas fotobioreaktora projektēšanas etapā par pamatu tika ņemti rezultāti, kas iegūti kultivējot mikroaļģes kolbās (ar apgaismojumu pievadītais enerģijas daudzums, aerācija, samaisīšana).

Mērogošanas kritēriji:

Maisīšana:

Kultivējot mikroaļges kolbās, tika konstatēts, ka papildu maisīšana palielina biomasas augšanas ātrumu, tādēļ laboratorijas reaktorā papildu maisīšana tika realizēta ar propellera tipa maisītāja palīdzību.

Aerācija:

Kolbās veiktajos eksperimentos tika noteikts optimālais aerācijas ātrums un CO2 koncentrācija. Tika pierādīts, ka pie tādiem nosacījumiem maspārnese nelimitē aļģu augšanas ātrumu. Tāpēc projektējot laboratorijas fotobioreaktoru, par aerācijas kritēriju tika ņemts aerācijas ātrums attiecināts uz reaktora darbības tilpumu. Tādejādi tika pieņemts, ka aerācijas ātrums ir tieši proporcionāls fotobioreaktora darbības tilpumam:

kur: Va1 – aerācijas ātrums kolbā, Va2 – aerācijas ātrums fotobioreaktorā, Vr1 – kolbas tilpums, Vr2 – fotobioreaktora darbības tilpums. Tad:

Apgaismojums:

Balstoties uz kolbu eksperimentos iegūtajiem rezultātiem par optimālajiem apgaismojuma parametriem, tika aprēķināts laboratorijas fotobioreaktoram nepieciešamais apgaismojums. Par apgaismojuma parametru tika pieņemta ar gaismu pievadītā enerģija uz tilpuma vienību:

Ei/Vr,

kur: Ei – ar gaismu pievadītā enerģija, Vr – fotobioreaktora darba tilpums.

Tā kā 1 µmol/m2/s = 0.2176 J, tad no tā izriet, ka:

Ei/Vr = 0.2176*I/Vr,

kur I – gaismas intensitāte.

Zinot optimālo un maksimālo apgaismojumu kolbā, iespējams aprēķināt nepieciešamo diožu skaitu vienai kolbai:

NLED = NLED_K*Iop/Imax,

kur: NLED – nepieciešamais diožu skaits pie maksimālās intensitātes, NLED_K – izmantotais diožu skaits vienas kolbas apgaismošanai, Iop – optimālā gaismas intensitāte, Imax – maksimālā gaismas intensitāte.

Tādējādi var pieņemt, ka nepieciešamais diožu skaits ir tieši proporcionāls fotobioreaktora darbibas tilpumam:

NLED_R = NLED_K*VR/Vk

Kur: NLED_R – diožu skaits fotobioreaktoram, NLED_K – diožu skaits kolbai, VR – fotobioreaktora darbības tilpums, Vk – kolbas darbības tilpums.

Projektējot laboratorijas mēroga fotobioreaktoru, notiek vienlaicīga izmēru palielināšana visos 3 virzienos. Tas nozīmē, ka vienlaicīgi samazinās laukuma/ tilpuma attiecība un līdz ar to laukums, caur kuru var pievadīt gaismas enerģiju. Lai nodrošinātu nepieciešamo gaismas enerģijas pievadi reaktorā, var palielināt apgaismojuma intensitāti, bet jāņem vērā, ka pārāk liels apgaismojums var izraisīt fotoinhibēšanu un šūnu bojāšanu.

Mērogošanas rezultāti

1.attels

1. attēlā parādīti mikroaļģu kultivēšanas rezultāti 0.4 l fotobioreaktorā (kolbā) un 4.0 l fotobioreaktorā pie vienādiem nosacījumiem. Ka redzams, biomasas iznākums un augšanas ātrums reaktorā ir mazāks nekā kolbā. To var skaidrot ar to, ka reaktorā aļģu biomasa gaismas enerģiju tomēr saņem mazāk. Lai to novērstu, var izmantot dažādus apgaismošanas algoritmus, piemēram, pakāpeniski palielināt apgaismošanas intensitātē un mainīt periodu diena/nakts.

Aktivitātes ietvaros tika veikts nozīmīgs izpētes darbs ar mērķi iegūt jaunas zināšanas un prasmes, lai varētu tikt izveidots rūpnieciska mēroga fotobioreaktors.

A/S “Biotehniskais centrs” un APP “Latvijas valsts koksnes ķīmijas institūts” sadarbības rezultātāaktivitātes ietvaros tika veikti 6 eksperimenti, izmantojot 3 dažādas barotnes – BBM, BBM+3N un BG-11 – un pārbaudīta to ietekme uz diviem H.Pluvialis celmiem (CCAC-0125 un CCAP-34/6). Eksperimentu laikā tika pakāpeniski palielināts apgaismojums, tādejādi izraisot aļģu šūnām „stresu”, kura rezultātā šūnas sāk producēt astaksantīnu.

Iegūtie 6 aļģu kultūru paraugi tika nodoti SIA „BELSS” uz liofilizāciju un analīzēm. Paraugos tika noteikta astaksantīna koncentrācija sausajā biomasā, izmantojot spektrometrofotometrijas metodi. Analīžu rezultāti parādīti sekojošajā tabulā:

 

Paraugs

Astaksantīna daudzums % uz sauso masu +standartnovirze

CCAP-34/6 BBM

1,355 + 0,008

CCAP-34/6 BBM+3N

3,142 + 0,019

CCAP-34/6 BG11

2,042 + 0,017

CCAC-0125 BBM

2,714 + 0,043

CCAC-0125 BBM+3N

2,689 + 0,084

CCAC-0125 BG11

2,263 + 0,027

Iegūtie rezultāti liecina par to, ka optimālākie augšanas apstākļi H. Pluvialis kultivēšanai un astaksantīna iegūšanai ir – CCAP-34/6 celms, barotne BBM+3N, 25 C, pH 7, apgaismojumu pakāpeniski palielinot no 50 µmol/m2/s līdz 600 µmol/m2/s, gaismas:tumsas periods attiecīgi 16:8 h, kratīšanas ātrums (130 rpm), gaisa-CO2 maisījums 96:4 v/v%, pievadot ar plūsmu 0.25 vvm.

SIA „BELSS” 6. aktivitātes ietvaros veica ekstrakcijas tehnoloģijas apskatu no energoefektivitātes viedokļa, kur lielu izmaksu daļu sastāda elektroenerģija. Tika apskatīti ekstrakcijas tehnoloģijas iekārtas ierīču un sistēmu plānošanas procesi, automatizācijas uzlabojošo procesu perspektīvas, procesu pārvaldība.

Pamatojoties uz rūpnieciskā pētījuma rezultātā iegūtajām zināšanām tika secināts, ka astaksantīna ekstrakcijas iekārtu risinājumi ir pieejami pasaules tirgū, galvenokārt Ķīnā. Veicinātas sadarbības iespējas ar Ķīnas ekstrakcijas iekārtu ražotājiem, saņemot ekstrakcijas iekārtas tehnisko piedāvājumu un rasējumus, kurus SIA „BELSS” plāno izmantot pēc projekta realizācijas.

Projekta laikā izstrādāta astaksantīna ekstrakcijas tehnoloģija, kā arī noteikti Haematococcus pluvialis aļģu kultūras optimālākie audzēšanas apstākļi laboratorijas apstākļos, ir adaptējami rūpnieciskā mērogā.

Projekta īstenošanas vieta –
A/S „Biotehniskais centrs” Dzērbenes iela 27, Rīga, LV-1006 (www.bioreactors.net)
SIA „Belss”Kalvenes iela 22A, Rīga, LV-1058 (www.belss.lv)
Sadarbības partneris:
Latvijas Valsts Koksnes ķīmijas institūts, Dzērbenes iela 27, Rīga, LV-1006 (www.kki.lv)
Projekts uzsākts: 01.01.2014 Projekts nobeigts: 30.04.2015
Kopējais projekta īstenošanas laiks– 16 mēneši.